在此我们验证了一种新型定制电生理系统（Slice XVIvoTM）的设计与应用，该系统能够对16个独立脑切片进行同步记录。该系统包含16个独立记录腔室，每个腔室内的电极均可手动调节并固定，从而实现对16个脑切片细胞外响应的同步刺激与记录。每个脑切片的响应由独立的刺激隔离单元激发，并通过独立通道进行记录，这使得每个切片诱发产生的细胞外活动均可独立控制与分析。该系统的设计使其可适配标准抗震实验台，因此Slice XVIvoTM系统相比当前其他多切片记录系统显著节省空间。我们已通过实验证明，该系统能够稳定获取海马CA1区的细胞外响应并成功诱导长时程增强效应。此外，研究显示Slice XVIvoTM系统在氧糖剥夺实验中能大幅提升化合物测试通量。总体而言，我们设计、构建并验证了一套具有显著成本与空间效益的电生理系统，该系统在提升实验通量的同时，最大限度减少了实验动物的使用数量。
一、介绍
脑切片电生理记录技术已应用超过50年，成为研究特定脑区与神经环路生理学及药理学特性的关键手段。该技术构建了重要的跨功能桥梁：一方面连接着针对孤立表达特定受体的体外细胞培养实验，另一方面衔接体内行为药理学研究。通过保持特定脑区内神经元与胶质细胞的原有结构，可在更接近生理环境的条件下设计突触功能研究实验，从而更好地模拟被认为与特定行为表现相关的神经生理活动。
展开剩余93%因此，脑切片研究范式能够在进行昂贵且耗时的体内实验之前，对已完成体外细胞培养测试的新化合物进行更有效的特性表征，这既提高了实验成功率，也减少了动物使用量。然而，传统的脑切片电生理实验装置通常每次仅能记录单个切片，即使可同时制备多个包含目标脑区的切片。这一缺陷严重制约了实验通量，无法有效减少动物使用，且因切片制备过程中存在的日常差异可能增加数据集的变异性。
近年来出现的少数多切片电生理系统虽能实现多个脑切片同步记录，从而减少动物使用并提升数据质量，但这些系统仅支持4至8个切片记录，占地面积较大且成本高昂。因此，开发一种能同步记录超过8个脑切片、更具空间与成本效益的系统，将显著提升实验通量，提高数据质量并优化动物使用效率。
本文验证了一种新型定制电生理系统（Slice XVIvoTM）的设计与应用，该系统能够同步记录16个独立脑切片。所有记录均在独立且结构相同的记录腔室中完成，使用统一的刺激与记录电极，并以均等的流速持续灌注恒温氧合溶液，从而最大限度降低实验变异性。我们通过两项常用脑切片检测方法证明，该系统能够记录稳定持久的响应，所获结果与使用传统脑切片系统发表的文献数据一致。
二、方法
01.十六通道 Slice XVIvoTM 电生理系统设计
本系统设计旨在实现最大数量的独立且相同的记录腔室，同时最小化其占地面积。包括设备和计算机在内的整个记录系统总占地面积为180厘米 × 120厘米（见图1A和C）。此优化配置是通过将所有16个独立的切片记录腔室集成在一张抗震台上实现的。
图1. Slice XVIvoTM记录系统。（A）整套记录系统的照片。Slice XVIvoTM系统在实验室中的总占地面积为180厘米 × 120厘米。（B）所用典型大鼠海马切片图片及电极在CA1区的放置位置。插图：定制电极夹持器的俯视图，显示固定就位的刺激电极与记录电极。（C）所有16个记录单元及其各自溶液储管的俯视图。（D）带有电极的手动操作器特写视图。
使用5400型CNC立式铣床加工了两块25毫米厚、透明挤塑丙烯酸板（400毫米 × 150毫米），每块板上加工出8个切片记录腔室（直径15毫米，深度8毫米）。每块板上，两排各4个腔室（每排腔室间距50毫米）沿长边交错排列，共计16个切片腔室。每个腔室在孔槽的对侧均设有入口和出口端口（直径均为3毫米），以便溶液灌注流过切片。此外，在每个腔室底部上方5毫米处铣削出一个唇缘，用于放置尼龙网圈，脑切片即置于其上。这使切片能完全浸没，溶液可以从切片上方和下方同时灌注。
深圳市富临神通科技有限公司（原“东莞市富临塑胶原料有限公司”）是 AMPI中国代理商，我们为客户提供Master-8、Master-9等电刺激产品。
为了照亮切片，在两个丙烯酸板的底面，每个记录腔室下方均铣削出一个小槽，用于放置白色LED灯。每个切片腔室旁边固定有一个丙烯酸立柱，其带有一根平行于丙烯酸板的10毫米横杆，上面装有一个三轴可调的C-1型夹持器。此设置使夹持器可平行于记录腔室自由滑动，一旦通过固定螺丝定位，即可在X、Y、Z方向上进行手动调节。我们设计了16个定制的丙烯酸电极夹持器，用于将刺激电极和记录电极固定就位（图2B插图），并通过C-1型夹持器固定。
图2. 记录装置示意图。此图示意了单个记录单元的装置配置。每个记录腔室均配有独立的溶液储管，用于对溶液进行加热和充氧。每个溶液管上的红外传感器用于检测液位，并触发夹管阀的开闭以维持恒定的溶液流速。每个记录腔室还配备有相同且独立的刺激电极和记录电极。由于每个前置放大器具有两个通道，相邻记录单元的信号在分别放大和数字化之前，共用一个前置放大器（图中未显示）。
02.灌注系统
Slice XVIvoTM 系统采用重力灌注系统，最多可容纳四个位于系统上方的主溶液储罐。此设置最多允许四种独立的记录条件（例如，对照、不同测试浓度和化合物），每种条件下最多四个切片；或两种不同的记录条件（例如，对照与化合物），每种条件下最多八个切片。来自每个储罐的流速由16个独立的夹管阀（外径1/8英寸管道，两组八个，PS-V8型号）调节，这些阀门由一个16通道阀门控制器控制。从16个阀门流出的溶液分别流入16个独立充氧的溶液腔室，这些腔室垂直固定在记录腔室上方。每个溶液腔室均固定在一个加热块内，该加热块连接至一个温度控制器，从而允许溶液在灌注到切片之前同时进行加热和充氧。通过将玻璃储液腔中的溶液液位维持在高于每个记录腔室的经验水平，可使溶液流速恒定保持在2毫升/分钟。每个玻璃管中的溶液液位通过一个聚丙烯浮子保持恒定，当溶液量低于设定阈值时，该浮子会阻断一束红外线。当红外线被阻断时，红外控制器会向16通道阀门控制器发送一个TTL脉冲，从而打开该溶液腔的阀门，使溶液量增加至超过红外线的水平。每个储液管的液位是通过经验确定，以确保每个记录腔室的溶液流速恒定为2毫升/分钟。在典型的实验日，配制10升ACSF，分装于两个各含5升ACSF的主储罐中，一个供应第1至8号腔室，另一个供应第9至16号腔室。因此，每个记录腔室2毫升/分钟的恒定流速，允许每个切片进行超过5小时的连续灌注。
此外，在16个溶液腔室各自之后、记录腔室入口之前的溶液管路中设有一个注射端口，允许通过使用注射泵进行独立的、急性的药物处理。
03.细胞外记录与刺激
来自记录电极的信号首先使用固定在记录腔室旁丙烯酸立柱上的2通道微型前置放大器进行放大。每个前置放大器可放大两个独立的输入信号，因此相邻的记录腔室共用一个前置放大器。每个前置放大器还包含一个接地通道和一个参考通道，来自每个输入通道的氯化银参考电极连接于此。信号从前置放大器出来后，通过信号收集器，然后由一个16通道可编程增益放大器放大50倍，总增益达到500倍。信号随后通过一个16通道信号分配器，连接到DigiData 1440的16个独立模拟输入端。使用同心双极铂/铱电极刺激记录腔室中的每个切片。
刺激命令在数据采集协议中生成，作为来自DigiData 1440的模拟输出信号发送至Master 8刺激发生器。发送至Master 8的模拟输出信号产生8个相同的输出脉冲，每个脉冲驱动2个独立的刺激隔离器。每个刺激隔离器连接一个同心双极电极，从而允许独立控制每个切片的刺激强度。由于每个通道本质上由一个独立的灌注系统和共享丙烯酸块内的储液腔组成，因此无需采取措施来防止相邻通道间的刺激伪迹干扰。
04.脑切片制备
实验使用7-9周龄雄性Sprague-Dawley大鼠，所有操作程序均符合相关动物管理与使用委员会的批准要求，包括最大限度减轻动物痛苦及减少动物使用数量。大鼠通过异氟烷麻醉后断头处死。迅速取出大脑并浸入含氧（95% O2–5% CO2）、冰镇蔗糖替代型人工脑脊液中，其成分为：220 mM蔗糖，12 mM MgSO4，10 mM葡萄糖，2 mM KCl，1.5 mM NaH2PO4，26 mM NaHCO3，0.2 mM CaCl2 （pH 7.4，渗透压290–300 mOsm）。将包含双侧海马的组织块进行对半切开，使用振动切片机从每个半球切取400微米厚的旁矢状切片。通常从每只大鼠脑中可获得8-10个含有海马CA1区的可用切片，因此每次实验使用2只大鼠。切片在含氧、室温的正常人工脑脊液中恢复至少1小时，其成分为：125 mM NaCl，2.5 mM KCl，1.3 mM MgSO4，2.5 mM CaCl2，25 mM NaHCO3，1.25 mM NaH2PO4，10 mM葡萄糖（pH 7.4，渗透压290–300 mOsm），随后转移至浸没式记录腔室进行记录。
05.实验流程
所有切片在记录腔室中就位后，借助数字显微镜为每个记录腔室将定制的记录电极与刺激电极置于海马CA1区的辐射层。所有通道的刺激电极与记录电极间距设定为0.5毫米。
场电位响应通过由Master 8刺激发生器驱动的独立刺激隔离单元，以每20秒（3赫兹）一次单脉冲刺激（0.1毫秒）诱发。各刺激强度调整至可诱发最大响应30–50%的水平。记录基线信号20分钟后，以相同刺激强度施加10次theta节律爆发式刺激诱导长时程增强（每次爆发包含4个100赫兹的刺激脉冲，爆发间隔200毫秒）。在此条件刺激后，进行1小时的测试期记录，期间再次以相同刺激强度每20秒（3赫兹）施加单脉冲刺激诱发响应。对于氧糖剥夺实验，将灌流液中的95% O2/5% CO2替换为95% N2/5% CO2，并以蔗糖替代葡萄糖，持续不同时间以诱导突触传递丧失。
在长时程增强与氧糖剥夺实验中，若切片记录的响应幅度小于0.5毫伏和/或在基线期最后10分钟内波动超过10%，则被排除在分析之外。基于这些参数，每次实验通常可获得12-16个稳定可用的记录数据。由于Slice XVIvoTM系统具备16切片同步记录能力，单次实验通常可设置2-3种不同记录条件。例如，多数实验按以下模板之一设计：对照（8切片） vs. 条件1（8切片），或对照（4切片） vs. 条件1（6切片） vs. 条件2（6切片）。因此，切片数少于8的条件反映单日实验的多通道数据，而切片数多于8的条件则代表多次实验数据的合并。
06.数据采集与分析
信号通过数字化采集系统以10千赫兹频率进行数字化采样，使用采集软件记录，并采用分析软件包进行分析。
07. 化学试剂
实验所用全部化学试剂均购自供应商。
三、结果
01.诱发场电位记录
为验证Slice XVIvoTM系统同时从16个脑切片获取稳定、独立电生理记录的能力，我们在16个记录腔室中分别对海马CA1区诱发并记录细胞外场电位。如图3所示，实验过程中可稳定地在每个通道诱发有效的场电位。此外，通过软件实时查看所有16个记录窗口的功能，使得能够对所有诱发响应进行实时监控。
图3. 使用Slice XVIvoTM系统记录的示例场电位响应。此图为单次实验中全部16个切片记录波形的屏幕截图。所诱发的细胞外响应平均幅度在1至2毫伏之间。
为了验证Slice XVIvoTM系统在药理学实验中的适用性，并确认所记录场响应的兴奋性本质，我们在70分钟的基线期后施加了AMPA受体阻断剂DNQX。图4显示，灌流应用10 µM DNQX能显著降低所记录场响应的归一化幅度（0.31 ± 0.07， n = 7）。这种场电位幅度的降低是可逆的，在冲洗掉DNQX后，响应可恢复至基线值。
图4. Slice XVIvoTM系统可产生稳定、兴奋性的场电位响应。该图展示了大鼠海马CA1区在70分钟内记录的稳定场电位。灌流应用AMPA受体阻断剂DNQX（10 µM，持续15分钟）导致平均归一化响应显著降低，该效应在冲洗后可逆恢复。图表上方展示了基线期、给药期及冲洗期的示例波形。
02.长时程增强的诱导
在验证了所记录场响应的稳定性和兴奋性本质后，我们进一步验证Slice XVIvoTM系统诱导和记录海马CA1区长时程增强的能力。在此实验中，根据基线刺激期间输入-输出曲线确定的强度，将每个切片的刺激强度设定为诱发最大响应的30-50%。建立基线响应后，记录一段20分钟的基线期（每20秒给予一次单刺激，频率0.33赫兹）。随后使用高频theta节律爆发式刺激方案诱导长时程增强，并记录60分钟的测试期。在基线期、theta爆发刺激期和测试期使用相同的刺激强度。如图5A所示，theta爆发刺激后归一化幅度出现显著增加（2.09 ± 0.25； n = 7），并在刺激后1小时内得以维持（1.54 ± 0.08； n = 7）。众所周知，theta爆发刺激后诱导海马CA1区的长时程增强需要激活突触后NMDA受体。与此一致，NMDA受体阻断剂MK-801能够阻止长时程增强的充分诱导，而不影响基线传递（图5A，60分钟时为1.23 ± 0.11； n = 3）。
图5. 大鼠海马CA1区长时程增强的诱导。（A）该图展示了长时程增强诱导前、诱导期间及诱导后平均归一化峰值幅度的变化。长时程增强通过theta节律爆发式刺激方案诱导（TBS – 10次爆发，每次爆发间隔200毫秒，包含4个100赫兹的刺激脉冲）。（B）图中展示了对照组（黑色）和5 µM MK-801处理组（蓝色）的基线期及TBS后示例波形，并附有比例尺。（关于图例中对颜色的引用说明，读者可参阅本文的网络版。）
这些数据表明，Slice XVIvoTM电生理系统能够可靠地进行长时程增强测量，并可用于评估新化合物增强或抑制海马内突触可塑性的能力。
03.中枢神经系统损伤的体外模型：氧糖剥夺
除了验证系统用于长时程增强记录外，我们还评估了该装置记录氧糖剥夺损伤期间突触功能丧失的能力。在这些实验中，分别用氮气替代氧气、用蔗糖替代葡萄糖，持续15、20和30分钟。与长时程增强实验类似，根据基线刺激期间的输入-输出曲线，将每个切片的刺激强度设定为诱发最大响应的30-50%。建立基线响应后，记录一段30分钟的基线期（每30秒给予一次配对脉冲刺激，间隔100毫秒，频率0.5赫兹）。如图6A所示，在氧糖剥夺期开始后10分钟，所有三个时间段的处理均导致记录的场响应近乎完全丧失（15分钟：0.15 ± 0.04， n = 6；20分钟：0.11 ± 0.02， n = 13；30分钟：0.10 ± 0.02， n = 8）。此外，功能的恢复程度取决于氧糖剥夺损伤的时间长度，15分钟的氧糖剥夺期在复氧复糖30分钟后可完全恢复（1.04 ± 0.12， n = 6），而20和30分钟的氧糖剥夺期仅导致功能部分恢复（20分钟：0.50 ± 0.18， n = 18；30分钟：0.35 ± 0.12， n = 13）。
图6. 氧糖剥夺后大鼠海马CA1区突触传递的丧失与部分恢复。A. 氧糖剥夺后恢复的时间进程。经过30分钟基线期后，切片分别经受15分钟（黑色）、20分钟（灰色）或30分钟（蓝色）的氧糖剥夺处理。可观察到响应平均归一化幅度在15分钟氧糖剥夺后完全恢复，而在20和30分钟氧糖剥夺后仅出现部分恢复。B. 预孵育60分钟并持续应用5 µM MK-801（蓝色）与对照组（黑色）相比，可更快地从氧糖剥夺中恢复。C. 对照组切片（黑色）与应用5 µM MK-801的切片（蓝色）的示例波形。时间点标示于波形上方。（关于图例中对颜色的引用说明，读者可参阅本文的网络版。）
由于Slice XVIvoTM系统的设置，每个记录腔室的灌流液由独立、单独充氧的储液腔供给。因此，在溶液流入各独立溶液管之前完成无葡萄糖溶液的切换，而过渡到完全无氧无葡萄糖溶液的时间受到储液腔中现有含氧含葡萄糖溶液被完全替换所需时间的缓冲。这导致需要更长的氧糖剥夺时间（从开始用氮气和蔗糖替换氧气和葡萄糖起至结束止测量）才能完全阻止功能恢复。由于每个独立溶液管平均容量为10毫升，流速为2毫升/分钟，完全替换溶液平均需要5分钟。在此背景下，我们的数据与先前发表的数据一致，表明在较短的氧糖剥夺时间间隔后功能完全恢复，而在较长时间氧糖剥夺后部分恢复或无恢复。
此外，我们测试了NMDA非竞争性拮抗剂MK-801对20分钟氧糖剥夺损伤的影响（图6B）。MK-801已被证明可通过缩短损伤后的恢复时间来增强氧糖剥夺后的功能恢复。切片在基线期前用5 µM MK-801灌流30分钟（氧糖剥夺损伤前总计60分钟），并在整个实验过程中持续灌流MK-801。如图6B图表所示，与对照条件相比，MK-801使氧糖剥夺损伤后的恢复速度显著加快（氧糖剥夺后10分钟的急性恢复期，MK-801组恢复至基线的61.6 ± 14.9%， n = 7；对照组恢复至基线的27.4 ± 6.4%， n = 18；p < 0.05，非配对t检验）。
这些数据表明，Slice XVIvoTM系统能够可靠地产生不同时长氧糖剥夺后突触功能的丧失和部分恢复，因此可用于在体外缺血模型中检测新化合物的神经保护特性。
四、结论
利用脑切片制备来测量功能反应的电生理学范式，例如长时程增强和氧糖剥夺，历来存在通量低、数据集内变异性高的问题。本文中，我们展示了Slice XVIvoTM电生理记录系统的实用性，能够从在相同条件下制备和维护的多个脑切片中获取记录。此外，这使得在同一实验中可以测试足够数量的对照和处理切片，从而在显著提高通量和数据质量的同时，最大限度地减少了动物的使用。
虽然目前的多切片记录系统具有各种优点，但其缺点包括：通量较低、实验室占地面积大、成本相当高或无法商业化获取。此外，尚无多切片系统能够同时记录超过8个切片，而Slice XVIvoTM系统具备16个并发记录的能力。Slice XVIvoTM系统占用的实验室空间也显著减少（总占地面积为180厘米 × 120厘米），并且成本相当低，约为市售系统价格的十分之一。
总体而言，在Slice XVIvoTM系统上进行的氧糖剥夺和长时程增强实验的重复性非常高。无论是氧糖剥夺损伤后的功能丧失，还是长时程增强条件刺激后的增强反应，均能稳定地呈现。然而，在这些实验的对照条件下可以观察到日间差异（尽管统计上不显著），即对照氧糖剥夺实验中的功能恢复程度，以及对照长时程增强实验中的增强程度，在不同实验日之间会略有不同。这种变异性似乎源于切片活力的日间波动，而切片活力波动可能由切片制备条件的微小差异引起（例如，大脑取出的速度、蔗糖切割液的温度、切片恢复的时间等）。对照条件下的这种变异性强调了为了进行有效的比较，需要在同一天从同一动物制备的切片中，在不同实验条件下获取记录的重要性。
尽管具有成本效益、空间效率和高通量的优势，但必须注意Slice XVIvoTM系统的一些局限性。首先，每个记录腔室的刺激和记录电极被设定为固定距离，以提供更好的记录可重复性。然而，当前配置无法实现需要独立移动和放置刺激与记录电极的实验。其次，由于记录电极的钝头、低阻抗特性，只能记录由细胞群体活动组成的诱发场响应。Slice XVIvoTM系统目前未配置用于获取单单位或细胞内记录，这些记录通常使用较高阻抗的金属电极或硼硅酸盐玻璃电极进行。最后，由于每对电极必须手动放置于切片上，且数据分析尚未自动化，Slice XVIvoTM系统需要比其他多切片系统更多的人为干预和劳动。
总之，Slice XVIvoTM系统提供了目前多脑切片记录系统中可用的最高通量。我们已通过获取与其他多切片系统一致的数据，验证了该系统在长时程增强和氧糖剥夺实验中的有效性。因此，该系统应在推动用于药物发现的切片电生理学发展中发挥重要作用。
深圳市富临神通科技有限公司（原“东莞市富临塑胶原料有限公司”）是 AMPI中国代理商，采购Master-8、Master-9等电刺激产品请立即联系我们。
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